Ryby, wirusy i szczepionki. W morzach i stawach toczy się nieustanny wyścig zbrojeń

Maria Hawranek: Co to znaczy, że jest Pan immunologiem porównawczym?

Krzysztof Rakus: Badam, jak ewoluowały mechanizmy immunologiczne, czyli związane z układem odpornościowym – od ryb, czyli niższych kręgowców, aż do wyższych, na przykład ludzi. Porównuję działanie tego układu u ryb i u człowieka, a także szukam mechanizmów specyficznych dla ryb, które można wykorzystać w ochronie ich zdrowia.

A dlaczego bada Pan akurat karpie?

Przez przypadek. Gdy byłem na czwartym roku studiów biologii na Uniwersytecie Śląskim w Katowicach, zobaczyłem ogłoszenie: „asystent w Zakładzie Ichtiobiologii i Gospodarki Rybackiej PAN w Gołyszu poszukiwany”.

To niedaleko Skoczowa, na Śląsku Cieszyńskim, skąd pochodzę. Zgłosiłem się i dostałem tę pracę. Najpierw jako asystent techniczny, a po skończeniu studiów – doktorant. Przy instytucie funkcjonowało gospodarstwo o łącznej powierzchni stawów ponad 700 hektarów, olbrzymi teren. Hodowano karpie o różnych liniach genetycznych, które różnią się wyglądem, ale też odpornością na rozmaite patogeny. Właśnie to mnie interesowało: zależności między genetyką i podatnością na zakażenia patogenami.

Do jakich wniosków Pan doszedł?

Zajmowałem się genami głównego układu zgodności tkankowej, które kodują białka prezentujące obce antygeny limfocytom T, czyli wyspecjalizowanym komórkom odporności nabytej, dzięki czemu komórki te mogą walczyć z różnymi patogenami. Badałem, czy określone warianty tych genów warunkują mniejszą lub większą odporność ryb na patogeny. I tak było w rzeczywistości. Dziś wykorzystuje się tę wiedzę, by wyhodować bardziej odporne linie karpia.

Z patogenów interesowały mnie przede wszystkim wirusy. Pod koniec lat 90. XX w. i w pierwszej dekadzie XXI w. na całym świecie spustoszenie siał KHV – koi herpes virus powodujący masowe śnięcie karpi hodowanych w celach spożywczych, ale również karpi koi, a to ryby osiągające bardzo wysokie ceny, dochodzące do kilkuset tysięcy dolarów. 

O rety! Ze względu na ich wartość symboliczną w krajach takich jak Japonia?

Wywodzą się z Japonii, owszem, ale są hodowane przez hobbystów na całym świecie. Organizuje się wybory Miss i Mistera Karpia Koi. Grono sędziów wybiera najpiękniejszego osobnika, którego cena może wzrosnąć do kilkuset tysięcy dolarów. Wirus spowodował problem – gdy któryś z wystawców przywoził zainfekowaną rybę, choć bez widocznych objawów choroby, to dochodziło do rozprzestrzeniania się wirusa na pozostałe osobniki. Hobbyści wracali do domu z medalami… oraz wirusem, który powodował duże straty finansowe w hodowlach.

W czasie wystawy wszystkie egzemplarze wpuszcza się do jednego zbiornika?

Nie byłem nigdy na takiej wystawie, ale wygląda to jak turniej tenisa – wybiera się rybki pływające razem w zbiornikach, które potem przechodzą do kolejnych etapów. W finałach umieszcza się je w jednym zbiorniku, by móc porównać kolorystkę czy krój ciała.

Choroba ma wysoką śmiertelność?

Wirus KHV zarówno w warunkach naturalnych, jak i hodowlanych powodował śmiertelność rzędu 80-90 proc. Szczęśliwie udało się go już opanować, m.in. dzięki szczepieniom.

Nie wiedziałam, że ryby się szczepi.

Ano właśnie! Kiedy przebywałem na Uniwersytecie w Liège w Belgii po doktoracie, pracowałem nad szczepionką przeciwko temu wirusowi. I udało nam się! Jednak ponieważ jest oparta na żywym, atenuowanym, czyli osłabionym wirusie, nie jest dostępna w Unii Europejskiej, ale w krajach azjatyckich karpie są nią masowo szczepione.

Czyli przyczynił się Pan do opanowania epidemii.

Nasze badania częściowo się do tego przyczyniły. Hodowcy skupili się też na prowadzeniu selekcji linii genetycznych, które cechowały się niską śmiertelnością w obliczu wirusa. W połączeniu z działaniami profilaktycznymi spowodowało to, że wirus nie stanowi już takiego zagrożenia jak na początku XXI wieku. 

W Polsce szczepi się ryby?

Nie, niezbyt wiele szczepionek zostało dopuszczonych.

A jakie mamy w ogóle rodzaje szczepionek?

Cztery: z zabitym wirusem, z wirusem atenuowanym („żywym, ale osłabionym”), z samym antygenem (czyli białkiem wirusa, które aktywuje odpowiedź immunologiczną) i wreszcie szczepionki DNA czy RNA, gdzie podajemy kwas nukleinowy, czyli matrycę, na której to dochodzi w organizmie do syntezy określonego antygenu, który aktywuje układ odpornościowy.

Szczepionki oparte na „żywych” wirusach są uważane za bardziej ryzykowne – teoretycznie może dojść do sytuacji, że wirus stanie się znowu zjadliwy, czyli zamiast chronić organizmy, będzie je w stanie zabić.

Jak mogłoby do tego dojść?

Jest mało prawdopodobne, by atenuacja przestała działać, skoro eliminowany jest gen odpowiedzialny za zjadliwość, ale jakieś minimalne ryzyko istnieje, dlatego Unia Europejska tych szczepionek nie dopuszcza.

Szczepionki DNA i RNA są dopuszczane m.in. w Norwegii i Kanadzie. Problem z nimi polega na tym, że trzeba ją podawać domięśniowo, osobnik po osobniku. W przypadku tańszych ryb takie szczepienie może się hodowcom nie opłacać. Najłatwiej szczepić poprzez immersję – dodanie szczepionki do wody, w której ryby pływają. 

Wirusowi KHV łatwiej było się rozprzestrzeniać ze względu na warunki panujące w wielkoskalowych hodowlach?

Na pewno warunki w takich hodowlach sprzyjają rozwojowi chorób. Może nie w przypadku karpi, bo one są nadal hodowane w bardziej sprzyjających okolicznościach przyrody – w stawach ziemnych – ale ryby hodowane w dużym zagęszczeniu w klatkach w morzach czy w rzekach są bardziej narażone na stres. Tym samym ich odporność jest niższa. Patogeny mają doskonałe warunki do rozwoju.

Po sieci krążą przejmujące filmiki z zaatakowanymi przez pasożyty łososiami atlantyckimi, które potem lądują na naszych talerzach.

Dlatego w niektórych hodowlach stosuje się antybiotyki, które pomagają te choroby zahamować, ale nie są one dobre dla konsumentów. Stąd ja bardziej koncentruję się na mechanizmach odporności i pracy nad szczepionkami, co umożliwi hodowcom zadbanie o zdrowie ryb.

Raz na czas możemy natknąć się na wiadomości, że jakaś ryba jest toksyczna. Np. w niektórych krajach arabskich nie można spożywać ryby maślanej. Jakie ryby można bezpiecznie jeść?

Dla nas najbezpieczniejsze są rodzime gatunki hodowane w jeziorach i stawach. Importowane ryby podlegają oczywiście badaniom, jednak niektórych gatunków rzeczywiście lepiej unikać. Ja stronię od pangi, ze względu na możliwość zanieczyszczenia metalami ciężkimi, obecność chemioterapeutyków i innych niekorzystnych dla nas substancji w jej mięsie.

Pamiętajmy, że jeszcze w latach 80. zdecydowana większość ryb, które lądowały na naszych stołach, pochodziła z rybołówstwa. Dzisiaj połowa ryb trafia do nas z akwakultury, a połowa z odłowów.

Ryba z odłowów jest zdrowsza, ale w tej chwili masowe odłowy stanowią zagrożenie dla równowagi wodnych ekosystemów.

To prawda, dlatego akwakultura to gałąź produkcji żywności, która najszybciej się rozwija – wielkość produkcji ciągle rośnie. Jej ślad węglowy jest znacząco niższy w porównaniu z np. hodowlą bydła. Ryby stanowią dla nas bardzo ważne źródło białka, zawierają kwasy tłuszczowe omega 3, ważne dla funkcjonowania serca czy mózgu. Natomiast sporo hodowli nie zapewnia im odpowiednich warunków do zdrowego wzrostu.

Mówił Pan, że w stawach ryby mają lepiej. Nie można przegiąć z liczbą karpi w stawie?

Pewnie to możliwe, ale trudno mi sobie wyobrazić masową obsadę karpi w stawie. Mają tam jednak zdecydowanie więcej miejsca do pływania niż w klatkach, mają dostęp do naturalnego pokarmu. Stąd mięso karpia jest zdrowsze niż ryby hodowanej w dużym zagęszczeniu, karmionej tylko sztucznym pokarmem.

Czyli powinniśmy docenić nasz rodzimy gatunek.

Zdecydowanie. Jednak wszyscy wiemy, jaki jest z nim problem – ma liczne ości i nie każdemu jego mięso smakuje. Polska słynie z produkcji karpia, tradycja hodowli sięga XII w., kiedy to przywędrował do nas z Czech. Hodowlę karpia w Polsce rozpoczęli cystersi. Wtedy spożywano go m.in. w długich okresach postu i w czasie świąt. Dziś w Polsce 80 proc. całej produkcji jest spożywane jako pokarm wigilijny.

Da się go kupić o innej porze roku?

Oczywiście, w Bawarii serwują go przez cały rok. Ale chyba najsmaczniejszy jest zimą. 

To prawda, że na Wigilię są specjalnie przygotowywane, czy to miejska legenda?

Żadna legenda, tylko dobra praktyka. W hodowli na różnych etapach rozwoju karpie są przenoszone do innego rodzaju stawów. Dobrzy hodowcy na kilka tygodni przed Wigilią przenoszą je do betonowego zbiornika z przepływającą woda, co powoduje ich oczyszczenie. Na co dzień żerują głównie na dnie, blisko mułu, z którego pobierają pokarm, stąd bierze się ten mulisty smak w przypadku źle przygotowanych karpi. Zimą karpie też mniej żerują. Więc jakiś sens w tym, że jemy go na Wigilię, jest.

Nadal bada Pan tradycyjne karpie?

Już mniej. Po powrocie na Uniwersytet Jagielloński w 2016 r. zacząłem pracę na kuzynie karpia, danio pręgowanym, po angielsku zwanym zebrafish, ze względu na charakterystyczne paski na boku. Ta niewielka rybka karpiowata jest dla biologów bardzo ważna, bo stanowi jeden z modelowych organizmów, na których prowadzi się różnego rodzaju doświadczenia. 

Dlaczego akurat danio?

Ma kilka charakterystycznych cech, m.in. larwy i embriony tej rybki są przezroczyste, więc embriolodzy mogą obserwować rozwój różnych narządów. Poza tym zajmuje niewiele miejsca – dorosłe osobniki mają do 5 cm. Występuje też u niego dymorfizm płciowy, czyli można łatwo odróżnić samca i samicę, co ma znaczenie przy rozrodzie tych rybek. W warunkach naturalnych rozmnażają się o wschodzie słońca – wraz z pierwszymi promieniami przystępują do tarła. Jeśli więc chcemy pracować na larwach danio, musimy go zmotywować do rozrodu.

Jak to robicie?

Na co dzień żyją w zwierzętarni w specjalnych akwariach, gdzie większość parametrów wody jest automatycznie sterowana – temperatura, pH, przewodność właściwa. Gdy chcemy uzyskać larwy, wyławiamy samce i samiczki, przenosimy je do tzw. zbiorników tarliskowych i zostawiamy na noc w ciemności. Rano światło nie włącza się od razu, tylko powoli, symulując wschód słońca. Jeśli wieczorem umieścimy rybki w takim zbiorniku, rano przystąpią do tarła, więc gdy przychodzimy do pracy, to mamy już na dnie zbiornika zapłodnione ikrzynki, z których rozwijają się larwy. 

W laboratoriach na całym świecie dostępnych jest wiele linii transgenicznych danio pręgowanego, czyli różnego rodzaju mutantów, które mają wyłączone określone geny. Możemy je wykorzystywać w badaniach, by sprawdzać, jak dany gen wpływa na odpowiedź immunologiczną ryby. To może mieć przełożenie na badania na człowieku.

Ile macie danio pręgowanych?

Zwierzętarnia, którą udało nam się stworzyć w Zakładzie Immunologii Ewolucyjnej na Uniwersytecie Jagiellońskim, liczy ponad 5 tys. dorosłych osobników i stanowi jedną z największych w Polsce. Nosi teraz dumną nazwę Zebrafish Core Facility, i jest to platforma dla badaczy z całego uniwersytetu. Np. na larwach danio wykonuje się ksenotransplantację komórek nowotworowych, więc ma zastosowanie w badaniach nad rakiem.

Rybki zabija się w celach badawczych?

Rzadko, gdyż większość badań prowadzimy na larwach. Dorosłe ryby zwykle utrzymuje się przy życiu do dwóch lat, a potem poddaje się eutanazji. Im starsze ryby, tym większa szansa, że pojawią się jakieś zakażenia, które będą zagrożeniem dla całej zwierzętarni. Są oczywiście pod stałą opieką lekarza weterynarii, który dba o ich dobrostan.

Badał Pan też mechanizmy gorączki u ryb.

Tak, to były badania prowadzone jeszcze na karpiach.

W przypadku ryb, które są zmiennocieplne, mówimy o gorączce behawioralnej – czyli zmianie w zachowaniu. Ryby wędrują do miejsc, w których temperatura wody jest wyższa, by w ten sposób podwyższyć temperaturę swojego ciała.

W literaturze opisano, że wspomniany na początku wirus KHV powoduje masowe śnięcia karpi, ale w określonej temperaturze – od 18 do 28 st. Celsjusza. Wiedzieliśmy też, że wirus KHV nie replikuje w temperaturze powyżej 30 st. Celsjusza. Postawiliśmy więc pytanie: czy jeśli zakażone ryby będą w gradiencie temperatury i będą miały możliwość przepłynięcia do zbiornika o temperaturze powyżej 30 stopni Celsjusza, to czy zaobserwujemy u nich gorączkę behawioralną i jaki będzie ona miała wpływ na rozwój choroby? 

Okazało się, że ryby, które wpłynęły do przedziału z wyższą temperaturą wody, w 100 proc. przeżywały zakażenie. W wysokiej temperaturze niektóre mechanizmy odpornościowe działają lepiej, a wirus nie replikował się. Udało nam się wykazać, że mechanizmy gorączki u ryb i człowieka są bliskie, co sugeruje, że do ich powstania doszło bardzo wcześnie.

Czyli hodowcy ryb w czasie choroby mogliby podnieść temperaturę całego zbiornika?

Teoretycznie tak, ale w przypadku stawów jest to bardzo trudne. Kontaktowali się ze mną hodowcy karpi, zastanawiając się, czy nie stworzyć w stawie enklaw z wyższą temperaturą. Niestety podgrzanie wody do ponad 30 stopni Celsjusza nawet latem to ogromny wydatek w naszej strefie klimatycznej.

A w naturze jakie to będą miejsca?

Bardzo nasłonecznione. W naturalnych stawach też jest gradient temperatury – pionowy, czyli im niżej, tym niższa temperatura, i poziomy – czyli miejsca zacienione i nasłonecznione. Jednak to nie jest tak, jak w laboratorium, gdzie zbudowaliśmy długie akwarium z trzema przedziałami o różnej temperaturze wody: 24, 28 i ponad 30 st. Celsjusza. Jego zbudowanie było bardzo trudne, zajęło nam pół roku.

Najbardziej fascynujące w tych badaniach było to, że udało nam się opisać, jak wirus wpływa na zachowanie ryb, by przebywały jak najdłużej w zbiorniku o niższej temperaturze, gdzie mógł się replikować.

Jak wirus to robi?

Podobnie jak u człowieka, u karpi gorączka jest wywoływana przez cytokiny prozapalne. To są białka produkowane przez komórki układu immunologicznego w momencie infekcji. Cytokiny działają na inne komórki i narządy. W mózgu m.in. powodują aktywację struktury odpowiedzialnej za podwyższenie temperatury ciała u człowieka, a u ryb – migrację do cieplejszych miejsc.

Okazało się, że wirus koduje białko, które wyłapuje cytokiny prozapalne odpowiedzialne za rozwój gorączki, żeby uniemożliwić tym cząsteczkom działanie i jak najdłużej utrzymać rybę w niskiej temperaturze, gdzie wirus może się replikować i zakażać. Udało nam się potem stworzyć wirusa pozbawionego genu kodującego to białko blokujące cytokiny. Ryby zakażone tym wariantem wirusa migrowały szybciej do ciepłej wody. 

A co bada Pan na danio pręgowanym?

Obecnie zajmuję się szczepionkami na bazie mRNA dla akwakultury. Pandemię covid-19 udało się nam zahamować m.in. dzięki masowym szczepieniom, w większości były to właśnie szczepionki mRNA, słabo do tej pory przebadane na rybach. Teraz z wykorzystaniem modelu danio pręgowanego badam szczepionki mRNA przeciwko wirusowi TiLV – tilapia lake virus, który powoduje masowe śnięcia tilapii nilowej. A jeśli chodzi o ryby słodkowodne, to tilapia nilowa jest w ścisłej czołówce pod względem produkcji na świecie. Głównie produkowana jest w Azji Południowo-Wschodniej, Afryce i Brazylii – ma ogromne znaczenie dla wyżywienia tamtejszych populacji. 

Patogeny zawsze będą się pojawiać, ale może nauczymy się dobrze zabezpieczać ryby, by jak najmniej z nich ginęło.

dr hab. KRZYSZTOF RAKUS jest profesorem Uniwersytetu Jagiellońskiego, immunologiem porównawczym, kierownikiem Zakładu Immunologii Ewolucyjnej na Wydziale Biologii UJ. Bada mechanizmy odporności ryb na patogeny.